北京大学第三医院乔杰院士领衔团队于7月22号在Nature Medicine上发表了题为“Gut microbiota–bile acid–interleukin-22 axis orchestrates polycystic ovary syndrome”的文章，报道了肠道菌群紊乱是导致多囊卵巢综合征的重要危险因素。下面对本文的研究思路和实验内容做详细的梳理和解读。
多囊卵巢综合征（Polycystic Ovary Syndrome, PCOS）
一种临床表现高度异质性的内分泌代谢紊乱症候群，是育龄妇女无排卵性不孕最主要的原因，以高雄、排卵异常和卵巢多囊样改变为特征，常伴发胰岛素抵抗。其发病机制仍不清楚，缺乏病因学治疗手段。
样本类型：人（包括粪便、血清、卵泡液、颗粒细胞），多种小鼠模型（包括血清、肠组织、卵巢、脂肪、粪便）；
样本数量：队列1：PCOS组（50）vs 健康对照（43）；队列2：PCOS组（49）vs 健康对照（47）人；实验方法：宏基因组测序，非靶向代谢组（LC-MS）、FACS、qPCR等。对PCOS组与健康组的宏基因组测序数据进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，显示两组样本存在不同的聚类模式（a），并发现普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）对两类群体分离有显著作用（b），且在PCOS组显著升高（c）；KEGG显示胆汁酸代谢是菌群变化引起变化的关键代谢途径之一（d）；非靶代谢组检测发现胆汁酸中的甘氨脱氧胆酸（GDCA）和牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）在PCOS患者的粪便和血清中显著下降（e，f）。B. Vulgatus与GDCA和TUDCA的相关性分析显示在粪便和血清中均为负相关（g，h）；有趣的是，有报道B. vulgatus会解偶联在肝脏中合成的共轭胆汁酸。胆盐水解酶基因（bsh）在PCOS组的B. vulgatus中显著高表达（i）。这些数据表明，B. vulgatus在PCOS女性肠道菌群中升高最为显著，进而影响了这些宿主体内GDCA和TUDCA的代谢2.PCOS粪便微生物群或B. vulgatus移植效应打乱胰岛素敏感性、卵巢功能、胆汁酸谱和IL-22生成针对上述变化，作者转到动物模型来做进一步研究——将健康对照组和PCOS患者的粪便分别移植到不同的小鼠中，让其接受包括糖耐量试验(GTTs)、胰岛素耐量试验(ITTs)、HOMA-IR等在内的多项试验。一组口服灌胃健康人或PCOS的粪便，PCOS组小鼠展示出胰岛素抵抗（a，b），破换的发情周期（c，d）；PCOS组小鼠的卵巢中囊肿样滤泡数量上升，更少的黄体（e）；生育实验表明，PCOS组第一胎幼崽数量下降（f）。另一组口服灌胃B. vulgatus，同样会引起胰岛素抵抗（g，h）并破换发情周期（i，j）和卵巢形态（k），本组实验是以灭活B. vulgatus为阴性对照，DHEA处理产生的PCOS样小鼠为阳性对照。为考察肠道菌群及其代谢物对免疫系统的作用，作者进一步分析小肠胆汁酸和免疫细胞。TUDCA水平在B. vulgatus或PCOS组肠中显著下降（l）。对肠免疫细胞产生的细胞因子mRNA进行检测，发现B. vulgatus组Il22 mRNA下降了约90%（m）。PCOS样小鼠中血清白细胞介素22（IL-22）水平也出现降低（n）；PCOS患者血清和卵泡液中IL-22水平显著低于对照组（o，p）。为鉴定产生IL-22的细胞，作者采用流式细胞术（FACS）检测来自小肠固有层（siLP）的3型天然淋巴细胞（ILC3s）。IL-22+细胞在CD45+谱系- RORγT+ ILC3s中的占比在B. vulgatus组显著下降（q，r）。上述发现表明，PCOS患者的肠道菌群，尤其是B. vulgatus，可以调节受体小鼠的胆汁酸谱并降低ILC3产生的IL-22水平。图2 PCOS粪便微生物或B. vulgatus移植小鼠产生PCOS样表型
3.施用IL-22或胆汁酸可改善PCOS小鼠的胰岛素抵抗、卵巢功能障碍和不孕接着作者对B. vulgatus小鼠施用IL-22或GDCA可降低其胰岛素抵抗（a，b），并显著扭转发情周期的紊乱（c，d），卵巢形态变化，（e-g），异常的激素水平（h，i），以及第一胎幼崽数量减少（j）。近期研究报道产前抗苗勒氏激素（PAMH）处理的小鼠具有与PCOS患者相似的神经内分泌特征。作者对PAMH小鼠，施用IL-22可恢复受损的发情周期、卵巢形态、激素和幼崽数量（k-r）。这些都表明IL-22可以改善PCOS样小鼠的胰岛素抵抗和不孕。4.胆汁酸–GATA3通路调控的IL-22改善PCOS样小鼠的胰岛素抵抗和卵巢功能障碍为研究胆汁酸是否能调节IL-22的分泌，从siLPs中分选ILC3s，进行培养，再用TUDCA或GDCA进行处理。在TUDCA或GDCA存在下，培养的ILC3s中IL-22蛋白和IL22 mRNA水平显著上升（a，b）；TUDCA口服灌胃小鼠也证实了这一发现（c，d）为确定胆汁酸调节IL-22表达的分子机制，对培养的ILC3s加入氨苯蝶啶（一种TGR5的拮抗剂）。GATA结合蛋白3（GATA3）的表达对ILC3亚群的稳态、发育和功能，以及IL-22的产生起着重要作用。氨苯蝶啶会阻断胆汁酸诱导的GATA3表达上升（e）；与体外数据一致，施用GDCA会导致小鼠肠道中GATA3 mRNA水平升高（f）。同样地，PCOS粪便或B. vulgatus处理小鼠的肠道中GATA3水平是降低的（g，h）。上述数据表明，GATA3信号通路参与了胆汁酸介导的IL-22生成调控。一方面，已报道白色脂肪组织褐变增加代谢率，会提高胰岛素抵抗。移植PCOS粪便的小鼠皮下脂肪和棕色脂肪的Ucp1、Pgc1a、Cited1和Cox8b mRNAs（棕色脂肪产热标志基因）水平明显低于对照组（i）；在B. vulgatus小鼠也观察到相似的现象（j），脂肪组织内多室脂肪细胞减少（k），皮下脂肪组织中UCP1表达减少（l）。B. vulgatus小鼠皮下脂肪和棕色脂肪中Ucp1和Pgc1a mRNAs的相对表达水平在施用GDCA或IL-22后显著升高（m）。另一方面，炎症在PCOS发病机制中也起着重要作用。为研究IL-22在颗粒细胞中是否具有抗炎作用，分离了人黄体化颗粒细胞，并用IL-22进行体外培养。施用IL-22会显著逆转PCOS患者颗粒细胞中CCl2、CCl20和IL1B mRNAs的表达升高（n），使分泌的CCl2、CCl20和IL-1β下降（o-q）。这些数据表明IL-22调控改善PCOS的胰岛素抵抗和卵巢功能障碍的机制可能包括脂肪组织褐变和抑制卵巢颗粒细胞的炎症反应。最后，作者得出B.Vulgatus - 胆汁酸 - IL-22轴协同调节PCOS作用机制的假设示意图（r）。图4 胆汁酸–GATA3通路调控IL-22改善PCOS样小鼠的表型- PCOS患者肠道中的普通拟杆菌（B. vulgatus）丰度增加，粪便和血清的甘氨酸脱胆氧酸（GDCA）以及牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）的水平降低，血清和卵泡液的白介素-22（IL-22）水平下降。
- 给健康小鼠移植B. vulgatus或PCOS患者粪便，会导致原本健康的小鼠出现PCOS样表型。
- 胆汁酸调节IL-22的产生，GDCA和TUDCA通过促进GATA3表达诱导肠3型天然淋巴细胞（ILC3s）分泌IL-22 。
- 向PCOS小鼠施用IL-22或GDCA可以减轻胰岛素抵抗，并能在一定程度上逆转PCOS，可能的机制是促进白色脂肪褐化以及抑制卵泡颗粒细胞发炎。
小编小评本研究的思路值得大家借鉴。采用了成熟的肠道菌群研究思路，从疾病到动物模型再回到疾病，从相关性到因果性的验证。宏基因组学与代谢组学相结合，找到了肠道菌群影响PCOS的途径，是通过B. vulgatus–胆汁酸–白介素22轴（3个明星分子的新组合），可能的机制是促进白色脂肪褐化以及抑制卵泡颗粒细胞发炎（紧握热点）。面对众多的差异菌群和差异代谢物时，如何联合分析如何化繁为简（降维分析）地找到故事轴，我们的大队列项目分析经验可以帮助你。
Qi X, et al. Gut microbiota-bile acid-interleukin-22 axis orchestrates polycystic ovary syndrome. Nat Med. 2019 Jul 22.